Nitrogén monoxid függő mitokondrium bioszintézis systemas lupus erythematosusban

Koncz Ágnes^{1,2 *}, Nagy György^2,3 és Perl András²

1:Országos Gyógyintézeti Központ, Haematológiai és Immunológiai Intézet Molekuláris Diagnosztikai Osztály

2:Departments of Medicine, and Microbiology and Immunology, State University of New York, College of Medicine, Syracuse, NY, USA

3: Semmelweis Egyetem ÁOK III. Belgyógyászati Klinika Reumatológiai és Fizioterápiás Tanszéki Csoport, I. Részleg, Budai Irgalmasrendi Kórház, Budapest

* A szerzö az MLDT-Heintel Alapítvány támogatásával részt vett a IFCC-FESCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (Glasgow, 2005. május 8-12) konferencián.

Összefoglaló

Sytemás lupus erythematosus (SLE) az egyik legszínesebb autoimmun betegség, jellemzője T és B limfocita regulációs zavar, kóros autoantitest termelés. SLE-ben számos immunregulációs zavarról számoltak be így a humorális és celluláris immunrendszer aktiválódása, a citokinháztartás megváltozása mellett jelentősen fokozott a nitrogén monoxid (NO) termelődés is. Jelen munkánk során vizsgáltuk az NO szerepét T sejt jelátvitelben fiziológiás viszonyok között és SLE-ben. T sejt aktiválódás során Ca²⁺ szignál mellett NO szignál és reaktív oxigén intermedier (ROI) termelődés is mérhető. NO kelátor C-PTIO jelenlétében Ca²⁺ és ROI szignál kisebb (p=0.001 vs. p=0.01). NO dózis függő mitokondrium bioszintézist indukál T limfocitákban. SLE-s betegek T sejtjeiben az aktivációra mérhető gyors Ca²⁺ szignál nagyobb (p=0.005), míg a fenntartott Ca²⁺ szignál kisebb (p=0.005). SLE-s betegek T limfocitái nagyobb méretű és nagyobb számú mitokondriumot tartalmaznak, mint a kontroll T sejtek (p=0.00017) A mitokondriumok Ca²⁺-ot képesek felvenni, raktárazni és üríteni, így a nagyobb mitokondrium mennyiség befolyásolhatja a Ca²⁺ szignált. Lupusos betegek T limfocitái és kontroll T sejtek hasonló mennyiségű NO-t termelnek, ugyanakkor SLE-s betegek monocitáinak NO termelése jelentősen meghaladja a kontroll monocitákét (p=0,0023) Kontroll T limfocitákban a gyors Ca²⁺ szignál nagyobb (p=0.01), míg a fenntartott Ca²⁺ szignál kisebb mértékű (p=0.01) NO kezelés hatására. Eredményeink szerint az SLE-s betegek T limfocitáinak NO függő mitokondrium bioszintézise szerepet játszik a kóros T sejt aktivációban.

Kulcsszavak: SLE, nitrogén monoxid, T limfocita

Rövidítések jegyzéke:

2-APB: 2-aminoetoxidifenil borát

IP₃: inositol-1,4,5-triszfoszfát

MPA: mikofenolát sav

MHP: mitokondriális hiperpolarizáció

NOS: nitogén monoxid szintetáz

C-PTIO: carboxi-2-fenil-4,4,5,5-tetrametil-imidazolin-1-oxil-3-oxid

ROI: reaktív oxigén intermediater

SLE: szisztemás lupus erythematosus

Bevezetés

A systemás lupus erythematosus (SLE) az egyik legtöbbet vizsgált autoimmun betegség, az immunkomplex betegségek prototípusa. Nőkben kilencszer gyakoribb, mint férfiakban, prevalenciája nők körében 1:800 és 1:1000 közé tehető, gyakoribb, mint számos jól ismert betegség. A betegség globális immunregulációs zavarral jár, SLE-s betegeken számos immunológiai paraméter változásáról számoltak be [[1],[2]]. Jelenlegi tudásunk szerint az SLE patomechanizmusában központi szerepet játszanak a T limfociták jelátviteli defektusai, melyek a citokin háztartás megváltozásához, az immunológiai tolerancia elvesztéséhez, fokozott B sejt aktivációhoz vezetnek [[3], [4], [5], [6], [7]].

A nitrogén monoxid szerepe mitokondrium bioszintézisben és T sejt aktivációban

A nitrogén momxid (NO) számos fiziológiás és patológiás folyamatban szerepet játszó molekula [[8]]. Nitrogén monoxid szintetáz enzimek (NOS) L-argininből nitrogén monoxidot szintetizálnak. Három különböző NOS izoformát ismerünk melyek, neuronális NOS (nNOS), indukálható NOS (iNOS) és endoteliális NOS (eNOS). Humán T limfocitákban eNOS és nNOS expresszálódik, T sejt aktiváció az eNOS és nNOS protein szinteket 15-szörösére növeli [17].

Az NO egyik legjobban ismert funkciója az értónus szabályozása. Az NO vazodilatációt okoz, növeli az oxigén szükségletet. Az utóbbi években derült fény az NO eddig ismeretlen hatásaira is: mitokondriális hiperpolarizációt, ATP depléciót okoz asztrocitákon, limfocitákon és Jurkat sejteken [[9], [10]]. Mitokondriális és citoplazmatikus Ca²⁺szignál váltható ki NO-t emittáló vegyületekkel (NO donor) [Error! Bookmark not defined.]. Jurkat sejteken a FAS indukálta apoptózis során NO termelés mérhető [[11]]. NO alacsony koncentrációban hatékonyan gátolja a citokróm-c oxidázt mely ATP deplécióhoz vezet [[12]].

Számos sejttípus mitokondriumának bioszintéze fokozható nitrogén monoxiddal. Az NO a mitokondrium bioszintézist cGMP függő peroxiszóma proliferátor l receptor 1a-n (PGC-1a) keresztül szabályozza. Jelenlegi ismereteink szerint barna zsírsejtek, U937 sejtek, HeLa sejtek és human limfociták mitokondrium bioszintézise befolyásolható NO-val [Error! Bookmark not defined., [13]].

NO számos sejtféleség apoptózisát okozhatja, leírták a makrofágok, T limfociták, myeloid sejtek, timociták NO indukálta apoptózisát . Az apoptózis folyamata több ponton befolyásolható NO-val, a sejtek pillanatnyi állapotától függ, hogy az apoptózist fokozó, vagy gátló hatása érvényesül inkább [[14]]. Az NO rövid féléletidejű molekula, a környezetében lévő szuperoxiddal (O₂^-) peroxinitritet (ONOO^-) képez. A peroxinitrit maga is oxidálószerkét hat, vagy átalakul nitráttá, mely stabil, jól mérhető, az NO termeléssel arányos mennyiségben termelődő vegyület. Máj mitokondriumokból peroxinitrit hatására Ca²⁺kiáramlás figyelhető meg [[15]]. Az NO viszonylag kevéssé vizsgált érdekes hatása, hogy citokróm-c kiáramlást okoz a mitokondriumokból. A citoplazmába jutó citokróm-c kaszpáz 3-at és kaszpáz 9-et aktivál, beindítva az apoptótikus kaszkádot [[16]]

.A T limfocita aktivációja citoplazmatikus Ca²⁺, ROI, nitrogén monoxid (NO) szignált és mitokondriális hiperpolarizációt indukál. A Ca²⁺mobilizáció az IP3 szintézistől függ mely receptorához kötődve az endoplazmatikus retikulumon a belső raktárakból Ca²⁺ ürülést eredményez. A membrán permeábilis IP3 receptor antagonista 2-aminoetoxidifenil borát (2-APB) csökkenti az aktivációra mérhető citoplazmatikus Ca²⁺szignált és NO szignált, továbbá gátolja a mitokondriális hiperpolarizációt. Nitrogén monoxid kelátor carboxi-2-fenil-4,4,5,5-tetrametil-imidazolin-1-oxil-3-oxid (C-PTIO) igen hatékonyan gátolja a T sejt aktivációra mérhető NO szignált, Ca²⁺szignált és mitokondriális hiperpolarizációt tehát nitrogén monoxid szükséges a T sejt aktivációhoz [[17]].

Nitrogén monoxid szerepe systemas lupus erythematosusban

Számos megfigyelés szerint megnő az NO termelés SLE-ben. Lupusos betegek szérumában magasabb a nitrát koncentráció (37+/-6 μM/l), mint kontrollokéban (15+/-7 μM/l; P < 0.01) [[18]]. A szérum nitrát szint korrelál a betegség aktivitásával, és az anti-DNS szinttel. MRL/lpr egér lép és peritoneális sejtjei több NO-t termelnek interferon gamma (IFN-g) és LPS hatására in vitro, mint az egészséges kontrollok [[19]].

N^G-monometil-L-arginin (nem specifikus NOS inhibitor) és L-N^6-1-iminoetil lizin (iNOS specifikus inhibitor) megakadályozta a glomerulonephritis kifejlődését, csökkentette az artritist MRL-lpr/lpr egéren [[20]]. Ugyanakkor MRL/lpr iNOS knockout egéren hasonló veseérintettség fejlődik ki, mint a vad típusú állaton [[21]].

Az egyik legfontosabb anti-apoptótikus mechanizmus a Bcl-2 családba tartozó ferhérjék szintézise. Bcl-2 proteinek expressziója fokozott lupusos betegek T limfocitáiban [[22]]. Bcl-2 proteinek expresszióját az NO szabályozza, NO donorok fokozzák Bcl-2 proteinek szintézisét mRNS és protein szinten [[23]].

lpr egéren [[24]].

Nitrogén monoxid indukálta mitokondrium bioszintézis befolyásolja a Ca²⁺szignált SLE-ben

A nitrogén monoxid szabályozza a mitokondriális potenciált és a mitokondrium bioszintézist. SLE-ben a T limfociták mitokondriális potenciálja tartósan magas, továbbá a szérum nitrát és nitrit szintje emelkedett, mely fokozott NO szintézisre utal. Mindezek alapján felvetődik az NO szerepe a lupusban megfigyelhető MHP-ban. T sejt aktivációra mérhető gyors Ca²⁺szignál nagyobb, míg a fenntartott Ca²⁺szignál kisebb lupusban. Elektronmikroszkóppal vizsgálva lupusos T sejtek több és nagyobb mitokondriumot tartalmaznak mint kontroll T sejtek [Error! Bookmark not defined.] A mitokondriumok Ca²⁺-ot képesek felvenni, raktározni és üríteni, így a nagyobb mitokondrium mennyiség befolyásolhatja a Ca²⁺ szignált.

Mitokondriumban expresszálódó aequprinnal transzfektált, permeabilizált HeLa sejteken az extracelluláris Ca²⁺3 mM koncentrációra történő emelésével érhető csak el mitokondriális Ca²⁺akkumuláció. Ugyanezen sejteket IP3 mobilizáló agonistával kezelve, jóval kisebb citoplazmatikus Ca²⁺szint emelkedés szükséges a mitokondriális Ca²⁺akkumulációhoz [[25]]. Elektronmikroszkóppal megfigyelhető hogy a mitokondriumok az endoplazmatikus retikulum közvetlen szomszédságában helyezkednek el, mely lehetővé teszi, hogy befolyásolják a citoplazmatikus Ca²⁺szignált [[26]].

SLE-s T sejtek esetében nagyobb mennyiségű Ca²⁺ ürült a belső raktárakból mint kontroll T sejteket vizsgálva [Error! Bookmark not defined.]. Kontroll T sejteket NO donor vegyülettel kezelve lupushoz hasonlóan a korai Ca²⁺szignál gyorsabb és nagyobb, míg a fenntartott Ca²⁺szignál kisebb [Error! Bookmark not defined.]. SLE-s T limfociták a kontrollhoz hasonló mennyiségű NO-t termelnek, ugyanakkor lupusos betegekből szeparált monociták lényegesen több NO-t termelnek, mint kontroll monociták [[27]].

Az SLE patogenézisében fontos szerepet játszanak az aktivált monociták (2. táblázat). Kontroll monocitákkal allogén CD4⁺T sejt proliferáció nem váltható ki, ellentétben lupusos betegekből szeparált monocitákkal, melyek az allogén CD4⁺ T sejt proliferáció hatékony stimulátorai. SLE-s monociták nagy mennyiségű neopterint és IFN-a-t termelnek [[28], [29]]. Lupusos monocitákkal néhány óráig együtt inkubált kontroll monociták mitokondriális potenciálja és citoplazmatikus Ca²⁺szintje emelkedik, mely feltehetően a monocitákból származó NO következménye [Error! Bookmark not defined.].

Az NO lupusban betöltött szerepének további vizsgálata közelebb vihet a betegség patogenézisének jobb megértéséhez és újabb, az eddigieknél hatékonyabb gyógyszerek kifejlesztéséhez.

Ez az összefoglaló cikk a J Immunol 2003, 171, 5188-97 Nagy G, Koncz A, Perl A. T cell activation induced mitochondrial hyperpolarization is mediated by Ca²⁺and redox dependent production of nitric oxide és a J Immunol 2004 173, 3676-3683 Nagy G, Barcza M, Gonchoroff N, Phillips PE, Per -A: Nitric oxide-dependent mitochondrial biogenesis generates Ca²⁺signaling profile of lupus T cells cikkek alapján készült.

[1] Gergely P. Klinikai Immunológia. Medintel, Budapest, 1997

[2] Nagy G. Brózik M. Varga L. Füst G. Kirschfink M. Kiss E. Gergely P. Usefulness of detection of complement activation products in evaluating SLE activity. Lupus 2000; 9(1): 19-25

[3] Perl A, Banki K. In Kemmer GM, Tsokos GC CH Eds, Molecular mimicry, altered apoptosis, and immunomodulation as mechanisms of viral pathogenesis in systemic lupus erythematosus. Humana Press, Totowa, NJ. 1999, 43-64.

[4] Kammer GM, Perl A, Richardson BC, Tsokos GC. Abnormal T cell signal transduction in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 2002, 46, 1139-54

[5] Csiszar A, Nagy G, Gergely P, Pozsonyi T, Pocsik E. Increased interferon-gamma (IFN-c), IL-10 and decreased IL-4 mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clin Exp Immunol 2000, 122, 464-70.

[6] Nagy G, Pallinger E, Antal-Szalmas P et al. Measurement of intracellular interferon-gamma and interleukin-4 in whole blood T lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Immunology Letters 2000, 74, 207-10.

[7] Nagy G, Koncz-A, Perl A Mitochondrial T cell signal transduction abnormalities in systemic lupus erythematosus Curr Immunol Rev 2005, 1, 62-68.

[8] Bredt DS. Endogenous nitrice oxide synthesis: biological functions and pathophysiology. Free Radic Res 1999, 31, 577-96.

[9] Beltran B, Mathur A, Duchen MR, Erusalimsky JD, Moncada S. The effect of nitric oxide on cell respiration: a key to undertanding its role in cell survival, or death. Proc Natl Acad Sci USA 2000, 26, 14602-7.

[10] Almeida A, Almeida J, Bolanos JP, Moncada S. Different responses of astrocytes and neurons to nitric oxide: the role of glycolitycally generated ATP in astrocyte protection. Proc Natl Acad Sci USA 2001, 26, 15294-99.

[11] Beltran B, Quintero M, Gracia-Zaragoza E, O'Connor E, Esplugues JV, Moncada-S. Inhibition of mitochondrial respiration by endogenous nitric oxide: a critical step in Fas signalling. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 13, 8892-97.

[12] Brown-CG. Nitric oxide and mitochondrial respiration. Biochem Biophys Acta 1999, 1411, 351-69.

[13]Nisoli E, Clementi E, Paolucci C. Mitochondrial biogenesis in mammals: the role of endogenous nitric oxide. Science 2003, 299, 896-9.

[14] Kim YM, Bombeck CA, Billiar TR. Nitric oxide as a bifunctional regulator of apoptosis. Circ Res 1999, 19, 253-6.

[15] Packer MA, Murphy MP. Peroxynitrite causes calcium efflux from mitochondria which is prevented by Cyclosporin A. FEBS Lett 1994, 2, 237-40.

[16] Brookest PS, Salinas EP, Darley-Usmar K, et al. Concentration dependent effects of nitric oxide on mitochondrial permeability transition and cytochrome crelease. J Biol Chem 2000, 275, 20474-9.

[17] Nagy G, Koncz A, Perl A. T cell activation induced mitochondrial hyperpolarization is mediated by Ca²⁺and redox dependent production of nitric oxide. J Immunol 2003, 171, 5188-97.

[18] Belmont HM, Levartovsky D, Goel A. Increased nitric oxide production accompained by the up-regulation of inducible nitric oxide synthase in vasculat endothelium from patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1997, 40, 1810-6.

[19] Gilkerson GS. The role of nitric oxide in the pathogenesis of spontaneous murine autoimmune disease: Increased nitric oxide production and nitric oxide synthase expression in MRL-lpr/lpr mice, and reduction of spontaneous glomerulonephritis and arthritis by orally administerd N^G- monomethyl-L-arginine. J Exp Med 1994, 179, 651-60.

[20] Reilly CM, Farrelly LW, Viti D. Modulation of renal disease in MRL/lpr mice by pharmacologic inhibition of inducible nitric oxide synthase. Kidney Int 2002, 61, 839-46.

[21] Gilkerson GS, Mudgeti JS, Seldin MF et al. Clinical and serologic manifestations of autoimmune disease in MRL-lpr/lpr mice lacking nitric oxide synthase type 2. J Exp Med 1997, 186, 365-73.

[22] Aringer M, Wintersberger W, Steiner CW et al. High levels of bcl-2 protein in circulating T lymphocytes, but not B lymphocytes, of patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1994, 10, 1423-30.

[23] Gerano AM, Hortelano S, Alvarez A, Martinez C, Bosca L Splenic B lymphocyte programmed cell death is prevented by nitric oxide release through mechanisms involving sustained Bcl-2 levels. J Clin Invest 1995, 4, 1884-90.

[24] Yu CC, Yang CW, Wu MS. Micophenolate mofetil reduces renal cortical inducible nitric oxide synthase mRNA expression and diminishes glomerulosclerosis in MRL/lpr mice. J Lab Clin Med 2001, 1, 69-77.

[25] Rizutto R, Brini M, Murgia M, Pozzan T. Microdomaind with high Ca²⁺ close to IP3 sensitive channels that are sensed by neighbouring mitochondria. Science 1993, 262, 744-47.

[26] Rizutto R, Duchen MR, Pozzan T: Flirting in little space: the ER/mitochondrial Ca²⁺liaison. SCI STKE 2004, 13, 215.

[27] Amin AR, Attur M, Vyas P. Expression of nitric oxide synthase in human peripheral blood mononuclear cells and neutrophils. J Inflamm 1995, 4, 190-205.

[28] Blanco P, Palucka AK, Gill M, Pascual V, Banchereau J. Induction of dendritic cell differentiation by INF-a in systemic lupus erythematosus. Science 2001, 294, 1540-3.

[29] Nagy G, Brozik M, Tornoci L, Gergely P. Diagnostic value of combined evaluation of neopterin and anti-DNA antibody levels for assessment of disease activity in systemic lupus erythematosus. Clin Exp Rheumatol 2000, 18, 699-705.