Tasks of the microbiology department in the hospital are discussed. Clinical microbiology laboratory plays a central role in the hospital epidemiology and in controlling of infectious diseases, respectively. Comparing the typing data of clinical isolates of the normal flora or those of the ubiquiter species occurring universally in the inanimated environment is a tool of the confirmation of their clinical or epidemiological relevance. Primary foci of infections and also origins and vectors of hospital infections could be recognized by analysis of data got by several phenotyping and molecular typing methods. Application of biotype and resistotype as epidemiological markers is demonstrated.
Keywords: clinical microbiology, infection control,
clinical relevance, biotyping, antibiogram
A klasszikus járványügyi mikrobiológia a betegektől nyert mintákból végzett tenyésztések mellett hagyományosan kiegészül a fertőző beteg környezetében végzett szűrővizsgálatokkal, a fertőzés feltételezhető forrásának (ételminta, vízminta, stb) tenyésztésével és az izolált baktériumtörzsek részletes jellemzésével. Ennek bevett lehetőségei (fágtípus és bakteriocin típus meghatározás) mára már veszítettek gyakorlati jelentőségükből (1,3), csak korlátozottan és megszorításokkal alkalmazzák őket, megtartva a hagyományos járványügyi laboratóriumi hálózat keretein belül. Bizonyos határok között viszont a "járványügyi" vizsgálatok végzése kórházi alkalmazásra is kiterjedt, hogy az eredmények késedelem nélkül a higiénés és infektológiai helyzet alakítására jogosult egységek rendelkezésére álljanak (3,4,8,12). Ebben elsősorban a laboratóriumi diagnosztikába már bevonult (főleg molekuláris biológiai, jelentős részben automatizált) lehetőségekre számítanak: szerológiai típusmeghatározó metodikák, DNS- és RNS-specifikus hibridizációs próbák, fehérje- és nukleinsav elektroforetikus vizsgálatok, a polimeráz-láncreakció és a ligáz-láncreakció alkalmazásai (1,4,9,11,12,13,17,18). Hazai körülmények között, ahol az egészségügy műszeres felszereltsége és pénzügyi háttere ezt még nem teszi lehetővé, a törzsek elsőfokú jellemzésének céljára a biotípus meghatározása ajánlható az antibiotikum érzékenységgel kiegészítve (1,3,10,13).
A klinikai mikrobiológiai laboratórium magas szintű diagnosztikai feladatot kell ellásson, ezt kívánja meg a színvonalas betegellátás. Eleme ennek az infekció súlyosságától függővé tett részletességű identifikálás, az infekció típusához és helyéhez igazodó, korszerű összetételű antibiogram lehetőleg kvantitatív érzékenységen alapuló meghatározása és az izolátumok megőrzése az esetlegesen igényelt további vizsgálatok biztosítása céljából. A laboratórium által kiadott lelet olyan orvosi dokumentum, amelyre terápia alapozható. Ezért az izolált baktériumok közül csak azokat tünteti fel, amelyeket a klinikus és a mikrobiológus együttesen, az adott mintában és az adott beteg esetében kórokozónak minősít. A laboratóriumi eredmény csak akkor válik leletté, amikor azt a vizsgálatot kérő orvos a kezébe vehette, nem pedig a laboratóriumi tevékenységek bevégeztekor.
A mai kor követelményeinek megfelelő mikrobiológiai laboratórium feladata továbbá az aktív részvétel az infekció kontrollban. Ez magában foglalja a kórházhigiénés szűrővizsgálatok végzését, a kórházi fertőzések jeleinek korai felismerését, a kórokozók előfordulási gyakoriságában vagy antibiotikum rezisztenciájában jelentkező változások figyelését, elemzését, jelzését is. Erre épül részvétele a racionális antibiotikum politika kialakításában és a nosocomiális fertőzések megelőzésében, így közvetve és közvetlenül is szolgálja a gyógyítás hatékonyabbá és gazdaságosabbá tételét.
Ebben a közleményben azokat a lehetőségeket foglaljuk össze, amelyek a hazai kórházi laboratóriumok átlagos felszereltsége mellett is elérhetők és példákkal támasztjuk alá gyakorlati megvalósításukat.
Baktériumtörzsek: A Központi Honvédkórház Mikrobiológiai Laboratóriumában klinikai vegyes anyagból izolált baktériumtörzsek közül random mintavétellel 80 Staphylococcus, 50 Pseudomonas, 44 vegyes Gram-negatív (Klebsiella, Enterobacter, Acinetobacter, Serratia) törzset választottunk ki.
Az identifikálás kereskedelmi gyorstesztekkel történt: Staphytest,Enterotest I,Nefermtest (LaCheMa), BBL Crystal Gram-Positive ID, Enteric/Nonfermenter ID System (Becton Dickinson), RAS-ID Gram pos, RAS-ID Gram neg (Biotest), MicroScan Gram Pos és Neg ID (Baxter) a gyártók által megszabott használati előíratok szerint.
A biotípus meghatározása az identifikáló tesztek eredményei alapján, a biokémiai próbákat tripletekbe sorolva, eredményüket helyértékük szerint értékelve történt.
A Pseudomonas aeruginosa fágtípusának és pyocin típusának meghatározását az ÁNTSZ Fővárosi Intézetének Fáglaboratóriuma végezte. Az antibiogram meghatározása korong diffúziós módszerrel (15) Mueller-Hinton agaron (Sanofi) történt rutinszerűen a következő antibiotikum sorokkal: Staphylococcus: oxacillin, erythromycin, lincomycin, gentamicin, ofloxacin, szulfamethoxazol/trimethoprim, vancomycin; Pseudomonas: cefoperazon, imipenem, meropenem, tobramycin, amikacin, netilmicin, ciprofloxacin; Gram-negatív: ampicillin, ampicillin/szulbaktám, amoxicillin/klavulánsav, piperacillin/tazobaktám, cefalexin, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim, imipenem, meropenem, gentamicin, amikacin, netilmicin, ciprofloxacin, ofloxacin, szulfamethoxazol/trimethoprim.
A rutin vizsgálati anyagból véletlenszerűen kiválasztott, a nosocomiális fertőzések kórokozóiként gyakorta előforduló speciesekbe tartozó izolátumok vizsgálata során az alkalmazott kereskedelmi tesztekkel kapott biotípusok száma az 1. táblázaton látható. Mind a felbontóképesség, mind a technikai kivitelezhetőség tekintetében a LaCheMa tesztek (Enterotest I, Staphytest, Nefermtest) és a Crystal panellek voltak a legkedvezőbbek, ez utóbbiak magasabb ára korlátozza sorozatbani felhasználásukat.
Minden súlyos infekcióhoz társuló mintából (pl. pozitív hemokultúrából) izolált baktériumot biotipizálással összehasonlítottuk az azonos speciesbe tartozó, azonos vagy közel azonos antibiotikum érzékenységű, de más helyről kitenyésztett izolátumokkal. Az illusztrációként felsorolt példák azt szemléltetik, csak a laboratóriumi eredmények, a klinikai háttér részletes ismerete nélkül, milyen mértékben adnak támpontot a statisztikai valószínűség szerint kétes kórokozói szerepű baktériumok klinikai relevanciájáról.
V.G. politraumatizált férfi beteg az Anaesthesiológiai és Intenzív Therápiás Osztályon feküdt. 1998. szeptember 10-én vett hemokultúrájából két másik Gram-negatív baktérium és egy Enterococcus faecalis törzs társaságában P. aeruginosa volt izolálható, amely mind antibiotikum érzékenysége, mind a biotípus meghatározások szerint azonos volt a szeptember 9-i trachea váladékból és a szeptember 11-én nyert vizeletből szignifikáns csíraszámban (105 csíra/ml) izolált törzzsel. Ezzel szemben a szeptember 11-i hemokultúrából egy koaguláz-negatív staphylococcus (KNS) kíséretében kitenyészett P. aeruginosa törzs mintavételi szennyeződésnek tűnt, további mintákból nem bukkant fel (2. táblázat).
Z.L-né szintén az Anaesthesiológiai és Intenzív Therápiás Osztály betege volt, 1998. augusztus 1-én vett hemokultúráiból Enterobacter aerogenes tenyészett ki. Az antibiotikum rezisztencia képe, a Biotest és Crystal biotípusok egyezése szerint a szepszis kanül-eredetű volt, ezzel azonos törzset izoláltunk a hemokultúra vétel másnapján eltávolított centrális vénakanülből is (3. táblázat).
Ezzel ellentétes például szolgál T.M. férfi beteg esete, aki az Általános Sebészeti Osztályon feküdt hasi műtétet követően. Hemokultúrájából és a műtéti sebből viszonylag ritkán előforduló kórokozó, Citrobacter freundii tenyészett. A két törzs azonos antibiotikum rezisztencia képe ellenére mindhárom módszer szerint különböző biotípusba tartozott, így egymással nem hozhatók kapcsolatba. Ebben az esetben az összehasonlító vizsgálat nem segített a szepszis forrásának felderítésében (4. táblázat), az valószínűleg a környezetben lett volna keresendő.
A nosocomiális eredetű szepszis leggyakoribb kórokozói a koaguláz-negatív staphylococcusok. K.J. a II. Belgyógyászati Osztályon feküdt, sorozatban vett hemokultúrái közül két epizódban is minden antibiotikumra érzékeny KNS törzset izoláltunk. Az identifikálás szerint viszont ezek más-más speciesbe tartoztak, ezáltal biotípusuk is különbözött, mikrobiológiai megközelítésből klinikailag nem voltak relevánsnak elfogadhatók (5. táblázat).
A klinikum a mikrobiológustól megváltozott szerepkör betöltését várja el: ki kell lépjen laboratóriumi elszigeteltségéből, részt kell vállaljon a diagnózis megalkotásában és a terápia megválasztásában is, osztozva természetesen az ezzel együttjáró felelősségben is (4,14). Ennek egyenes következménye az, hogy csökken a felesleges vizsgálatok száma ("visszaesik" a laboratórium teljesítménye) és a laboratórium nem árasztja el klinikailag irreleváns izolátumokra vonatkozó jelzésekkel a vizsgálatokat kérő osztályokat (azaz nő a laboratóriumi tevékenység eredményessége). Változik viszont a vizsgálatok összetétele. Emelkedik a beteghez és diagnózishoz közvetlenül nem kapcsolható (el nem számolható) vizsgálatok száma, és a laboratóriumi diagnosztika hatásfoka.
A kórházi eredetű fertőzések megelőzése az infektológia, a klasszikus kórházhigiéne és a klinikai mikrobiológia összehangolt tevékenysége árán valósulhat meg a nosocomiális felügyelet (surveillance) formájában. Az erre épülő infekció kontroll mindazon tevékenységek összessége, amelyek célja a kórházi infekciók számának csökkentése (5). Az infekció kontroll a klinikai mikrobiológus tevékenysége révén válik előremutatóvá: lehetőség nyílik arra, hogy a járványt még kialakulása előtt felismerjék és a járványtörzsek tovaderjedését megakadályozzák (4, 8).
Ennek feltétele, hogy a klinikai minták feldolgozásával párhuzamosan, ugyanabban a laboratóriumban, ugyanazon szakembergárdával és ugyanazon módszerek igénybe vételével történjen a kórházhigiénés szűrőminták és a surveillance kultúrák feldolgozása és kiértékelése is (4,8). Ez az összetett vizsgálati anyag biztosíthatja csak, hogy a mikrobiológusnak folyamatosan aktuális információi legyenek az előforduló kórokozók gyakoriságáról, antibiogramjáról, a környezetben megtelepedett baktériumok megoszlásáról. Az ezekben jelentkező bármilyen változást (új rezisztencia típus, azonosnak tűnő baktériumok különböző mintákban, fokozottan veszélyes nosocomiális patogének megjelenése) azonnal észleli és jelzi. Mindez nagyobb figyelmet kell kapjon a fokozott fertőzésveszélyt jelentő osztályok (pl. intenzív terápiás osztályok, égett vagy neutropéniás betegeket ápoló részlegek, stb) esetében.
Az infekciók jelentős részében, a nosocomiális fertőzések mára már túlnyomó többségében olyan mikroorganizmus a kórokozó, amelyik az emberi test állandó normál flórájának (pl. Escherichia coli, streptococcusok, enterococcusok, staphylococcusok, endogén fertőzéseket okozó anaerob speciesek, sarjadzógombák) vagy időszakosan a tranziens flórának a lakója (pseudomonasok, acinetobacterek, stb). Az izolátumok jelentős része esetében ezért a klinikai szerep nem egyértelmű, a laboratórium nem érheti be a "pozitív" tenyésztési eredmény mechanikus közlésével. A jellemző tünetek megléte, valamint az ismételten kitenyésztett izolátumok összehasonlító mikrobiológiai vizsgálata az, ami az összetartozó, feltételezhetőleg klinikailag releváns törzsek megerősítésében és a mintavételi szennyeződések felismerésében segíthet (4).
Kulcsszerep hárul a mikrobiológiai laboratóriumra a kórházi fertőzések megelőzése terén. A járványtörzs azonosítása, forrásának tisztázása és a továbbadódás útvonalának feltérképezése is fontos feladat. Ezt elősegíti, ha a laboratórium a gyanús törzseket részletesen jellemzi, az adatokat összehasonlítva az azonosnak tűnő izolátumokat kiszűri, szükség esetén további, részletesebb vizsgálatok vagy a következtetések megerősítése céljából erre specializálódott járványügyi laboratóriumba továbbítja (4,8).
A jellemzés célja az összehasonlíthatóság megteremtése, azoknak a tulajdonságoknak a meghatározása, amelyek a speciesen belül különbözőek lehetnek. Az egyes jellegzetességek (markerek) járványügyi felhasználhatóságát stabilitásuk és speciesen belüli diverzitásuk határozza meg (1,3,12). Az egyes módszerek alkalmazhatóságát a tipizálhatóság (az adott módszerrel jellemezhető törzsek száma), a felbontóképesség foka (érzékenység), a reprodukálhatóság (a vizsgált jelleg stabilitása), és az epidemiológiai illeszkedés határozza meg: a járványügyi szempontból összetartozó törzseket egyezőnek, az egymással nem összefüggőeket különbözőnek határozza-e meg, vagyis az eredményekből helytálló járványügyi következtetések vonhatók-e le (4,13).
Egyetlen metodika sincs, amely minden mikroorganizmus vizsgálatára egyaránt megfelelő lenne. Speciesenként kell kiválasztani a legmegfelelőbb eljárást vagy eljárások kombinációját, figyelembe véve a laboratórium lehetőségeit is. Elsősorban azon vizsgálatokra kell támaszkodni, amelyeket a laboratórium diagnosztikai alapfeladatainak ellátására is alkalmaz.
A baktérium vagy gomba izolátumok biokémiai vagy szerológiai eszközökkel történő azonosítása és antibiotikum/antimikotikum rezisztenciájának meghatározása az egyes izolátumok összehasonlítására is alkalmas. Az identifikálásra használt automatizált vagy vizuális detektálású rendszerek eredményének kiértékelése rendszerint számsort eredményez, mely biokémiai profilt, biotípust is jelent (1,4,13). Egyezményes biotípus meghatározási sémák híján az alkalmazó laboratórium döntésétől függ, mely kereskedelmi tesztet választja. A tipzálhatóság teljes, gyakorlatilag minden izolátum esetében értékelhető eredményt ad. Speciesen belül a lehetséges biotípusok száma viszont korlátozott, ezért a biotípus-meghatározás érzékenysége viszonylag alacsony. Reprodukálhatósága változó: az egyes biokémiai próbák eredménye változhat a tenyészet korától, csíraszámától, a baktérium szaporítására használt táptalajtól, stb (12).
Az antibiotikum-rezisztencia profil azoknak a vizsgált szereknek a felsorolása, amelyekre az adott törzs rezisztens. Ez egy adott pillanatban jellemző a vizsgált törzsre. Az érzékenységi kategóriák (érzékeny, mérsékelten érzékeny, rezisztens) közlése kiegészítve a gátlási zónaátmérők megadásával még több információt nyújt (2). Azonos rezisztencia-profilú törzsek között különbség mutatkozhat a rezisztencia fokában, azaz a MIC értékekben is (6,10).
Egyre több molekuláris biológiai módszert alkalmaznak a hazai kórházi laboratóriumok is. Ezek egy része segítheti a mikrobiológiai diagnózis gyors és pontos megszületését és ezen túlmenően kiegészíthetik azt virulencia bélyegek vagy rezisztencia gének exakt kimutatásával is. Elsősorban elektroforetikus és nukleinsav alapú technikák alkalmazása jöhet szóba e tekintetben (1,4,7,9,12,13). A sejt összproteinjének vagy külső membrán proteinjeinek poliakrilamid gél elektroforézisét (PAGE) nagy felbontóképességének köszönhetően sok species esetén használják a mikroorganizmusok jellemzésére. A nukleinsav alapú technikák közül az össz-DNS elektroforézis, ennek érzékenyített változata, a pulzáltatott mezejű gélelektroforézis (PFGE), valamint a legkorszerűbb diagnosztikus eljárásnak számító polimeráz láncreakció (PCR) alkalmazható ún. járványügyi megközelítésre is. A nagy pontosságú és gyors mikrobiológiai eredmény születését az átlagos laboratóriumi precizitás betartása mellett az egyszerűen kivitelezhető diagnosztikus kitek összeállítása biztosítja.
Ugyanezen elven, a tetszőlegesen kiválasztott nukleinsav szakaszok mesterséges megsokszorozásán alapul a technika infekció kontroll irányában történő felhasználása is. Az AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) alkalmazásban a mesterségesen aprított DNS-t vetik alá PCR amplifikációs ciklusoknak, a detektált fragmentek mérete és száma közötti eltérés differenciál az egyes törzsek között (17). A ribotípus meghatározás során a riboszóma génjeinek heterogenitását vizsgálják (11), a repetitív PCR technika a többszörösen ismétlődő DNS szakaszok kimutatásán alapul (17,18). A legszéleskörűbben alkalmazott lehetőség a véletlenszerűen hasított DNS elegy amplifikációja (Randomly Amplified Polymorphic DNA, RAPD), mely teljesen egyedi, más törzsekétől különböző profilt nyújt. Több gyártó állít elő ezekre a vizsgálati irányokra is "ready-to-go" elvű, előre preparált paneleket.
A molekuláris eljárások műszer- és részben munkaigényesek, sorozatvizsgálatokba ezért nem vonhatók be. A kórházi járványokban, az izolátum-szám esetenként kisebb, a fellépő járvány esetleges súlyos kimenetele pedig indokolttá teszi, hogy gyors, jó reproducibilitású, nagy felbontóképességű és pontos vizsgálatok álljanak az infekció kontroll szolgálatában.
A Központi Honvédkórház Mikrobiológiai Laboratóriuma 1997 végére felkészült a PCR technika bevezetésére, ezen keresztül a korszerű infekció kontroll mikrobiológiai alapjainak biztosítására is. Mivel ez a diagnosztikus szolgáltatás akkor és ott más keretek között vált valóra, kiragadva ezáltal a klinikai és epidemiológiai összefüggések rendszeréből, a molekuláris biológiai vizsgálatok pótlására a kisebb felbontóképességű módszerek - a biotipizálás és antibiogram - kombinációját voltunk kénytelenek alkalmazni. Az eredmények a beküldő osztályokkal folytatott folyamatos kapcsolattartás, személyes megbeszélések kiegészítőjeként hozzájárultak a mikrobiológiai eredmények klinikai relevanciájának emeléséhez, az infektológiához kapcsolódó gyógyító-megelőző tevékenység színvonalasabbá tételéhez. Valamennyi bemutatott esetünk azt példázza, hogy az antibiogram és a megfelelően megválasztott biotípus közlése a kezelőorvosnak többlet információt nyújthat az izolátumok klinikai szerepének megítélésében.
A kórokozók jellemzésére irányuló vizsgálatoknak is helyük van az általános profilú kórházi mikrobiológiai laboratóriumban. Nem engedhető, hogy a NM 18/1998. rendeletének hatálya a teljes mikrobiológiai gyakorlatot a kórházakból az ÁNTSZ szervezeteire ruházza át (16), vagy hogy piaci orientáltságú, nyereségérdekelt vállalkozások privilégiumává váljanak egyes korszerű diagnosztikai lehetőségek. Habár mindez műszerezettséget feltételez, beruházást igényel, a ráfordítások két irányból is megtérülnek. A direkt megtérülés abból adódik, hogy a molekuláris biológiai vizsgálatok jelenleg a kis számú jól finanszírozott beavatkozások közé tartoznak, a térítés meghaladja a ráfordítást, ezáltal járóbetegellátás terén (pl. Mycobacterium tuberculosis, Chlamydia tnachomatis, Neisseria gonorrhoeae kimutatásával) effektív és gyorsan érzékelhető gazdasági hasznot hoz végzőjének. Az indirekt megtérülés az infekció kontroll általi hasznosulás oldalán jelentkezik az ápolási idő és az ápolási költségek csökkenésében. Ezek nem könnyen mérhetők, financiálisan nehezen mutathatók ki, de már rövid távon is éreztetik hatásukat.
A szerzők köszönetet mondanak a Központi Honvédkórház Mikrobiológiai Laboratóriuma valamennyi munkatársának 1996 és 1999 között végzett áldozatkész munkájáért, valamint dr. Hérmán Gábornak és dr. Szabó Györgynek (ÁNTSZ Fővárosi Intézete) a Pseudomonas aeruginosa törzsek fág- és pyocin-tipizálásának elvégzéséért.
Arbeit RD: Laboratory procedures for the epidemiologic analysis of microorganisms. In: Murray, P. R., Baron, E. J. et al (eds): Manual of clinical microbiology, 6. kiadás, ASM, Washington, D. C., 1995, 190-208. old.
Bajó G, Barcs I: Az antibiotikum érzékenység automatizált kiértékelésének előnyei a klinikai mikrobiológiai laboratóriumban Infektol Klin Mikrobiol 2000; 7: (nyomdában)
Barcs I: Összehasonlító mikrobiológiai vizsgálatok a klinikai és a járványügyi mikrobiológiában Infektol Klin Mikrobiol 1996; 3: 142-146
Barcs I: Hogyan segítheti a klinikai mikrobiológiai laboratórium az infekció kontrollt? Infektol Klin Mikrobiol 1998; 5: 172-179
Benenson AS: Control of communicable diseases in man, 11. kiadás, American Public Health Association, New York, 1970, 295. old.
Courvalin P: Interpretative
reading of in vitro antibiotic susceptibility tests (the antibiogramme).
Clin Microbiol Infect 1996; 2 (Suppl. 1): 526-534.
Deák J, Nagy E, et al.:
Laboratóriumi diagnosztikai módszerek a Chlamydia trachomatis fertőzés
kimutatására alacsony fertőzöttségi kockázatú populációban
Klin Kísérl Lab Med 1997; 24: 35-44
Emori TG, Gaynes RF: An overview of nosocomial infections, including the role of the microbiology laboratory Clin Microbiol Rev 1993; 6: 428-442
Fodor E, Bácskay T, Nagy Á et al.:
Pulzáltatott mezejű gélelektroforézis alkalmazása a humán patogén candidák
kariotipizálására
Klin Kísérl Lab Med 1997; 24: 179-188
Kemme JA, Sloos JH, et al.: Rapid screening of strain identity by the use of automated antibiogram reading combined with cluster analysis. In: IMBEM IV, Fourth International Meeting on Bacterial Epidemiological Markers, Elsinore, Denmark 10-13 September 1997, Proceedings., 61. old.
Kostman JR, Alden MB, et al.: A
universal approach to bacterial molecular epidemiology by polymerase chain
reaction ribotyping.
J Infect Dis 1995; 171: 204-208
LiPuma JL: Molecular tools for epidemiologic study of infectious diseases Pediatr Infect Dis J 1998; 17: 667-675
McGowan JE, Jr: New laboratory
techniques for hospital infection control
Am J Med 1991; 91 (Suppl. 3B): 2455-2515
Mestyán Gy. A konzultáló klinikai mikrobiológus Infektol Klin Mikrobiol 1998; 5: 124-133
National Committee of Clinical Laboratory Standards: Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. 6. kiadás, 1997; NCCLS 17: M2-A6.
A népjóléti miniszter 18/1998. (VI.
3.) NM rendelete a fertőző betegségek és a járványok megelőzése érdekében
szükséges járványügyi intézkedésekről.
Népjóléti Közlöny, 1998; 48: 1305-1520
Struelens MJ: New typing methods. In: IMBEM IV, Fourth International Meeting on Bacterial Epidemiological Markers, Elsinore, Denmark 10-13 September 1997, Proceedings., 10. old.
Versalovic J, Koeuth T, Lupski
JR: Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to
fingerprinting of bacterial genomes
Nucleic Acid Res 1991; 19: 6823-6831.