Évente 2-3 millió beteg szenved hypercoagulacio okozta venas thrombozisban az USA-ban es kb. 60,000 beteg hal meg ezen thrombozisok szövődményeként. A hypercoagulacios állapotok okaként veleszületett és szerzett okok szerepelnek. Az állapot okának diagnózisa csak számos laboratóriumi teszt alkalmazása után kísérelhető meg. Ezen tesztek véralvadási-faktorok aktivitási vizsgálatából és genetikai tesztekből állnak. Egy beteg diagnosztikus feldolgozása 1,500 dollárt is meghaladhat. Kórházunk Laboratóriumában (orvosegyetemi oktató kórház) kidolgoztunk egy klinikai alapú, racionális diagnosztikus folyamatot amit a pathologia rezidens közreműködése által minden hypercoagulacios vizsgálatot igénylő betegnél betartattunk. Ez a gyakorlat hat hónap alatt 27%-os költségmegtakarítást eredményezett és jelentősen meggyorsította a betegek diagnózisának felállítását. A klinikai algoritmust jelenleg rutinszerűen alkalmazzuk és az egyetem két másik oktató kórházában is bevezetésre javasoljuk.
A hyperhomociszteinemia az ischaemias cardiovascularis betegségekben önálló rizikófaktor, kapcsolata a stroke-al még nem tisztázott kellően. A MTHFR 677C-T allél termolabilis variánsa magasabb homocisztein koncentrációval járhat. Célunk volt vizsgálni stroke betegekben a homocisztein koncentrációt, a MTHFR 677 C-T gyakoriságot kontroll csoporttal szemben. Összefüggést kerestünk a polimorfizmus prevelanciája valamint a betegek családi anamnesisében előforduló rizikófaktorok és a betegek egyéni vascularis rizikófaktorai között.
249 stroke beteg (CT, CDS) és 173 egészséges véradó. Kérdőívvel vizsgáltuk a családi anamnesisben a stroke, MI, AV obl. folyamat, hypertonia és diab. mell. előfordulását. A genetikai vizsgálatokat PCR metodikával végeztük.
Stroke betegekben magasabb homocisztein koncentráció mérhető (kontroll átl: 8.7 µmol/l, beteg: 13.8 µmol/l) (p<0.05). Ez különösen a magas quaritilisben kifejezett. MTHFR +/+ allél prevalencia hazai egészségesekben 15,2%. Stroke betegek és egészségesek között az OR: 1.16 (96% C1), ez fiatal 50 év alattiaknál 1.48. A betegek családi anamnesisének adatai között a +/+ allél szignifikánsan magasabb arányban fordult elő a stroke és diabetes mellitus csoportban, mint a -/- allél. (Fisher teszt p=0.05 és p=0.02). Többszörös kockázati tényezők (dohányzás, hyperlipidemia, hypertonia, diabetes) és MTHFR polimorfizmus +/+ és +/- alléljei között szignifikáns összefüggés volt a -/- allélal szemben (Fisher teszt p=0.03)
A hyperhomociszteinémia különösen a magasabb koncentrációban stroke rizikófaktora lehet. A MTHFR termolabilis variánsa fiatal stroke betegekben rizikóemelkedést eredményez, különösen, ha endothel károsító hagyományos rizikófaktorokkal társul. A homocisztein koncentráció széleskörű vizsgálata szükséges stroke betegekben. Ha ezt nem alacsony fólsav, B6 Vitamin vagy B12 Vitamin okozza szükséges a MTHFR 677 C-T meghatározása is.
A véralvadás XIII-as faktorának (FXIII) A alegységében található polimorfizmusok közül különösen figyelmet érdemel a Val34Leu polimorfizmus, mely az aktivációs peptidben (AP), a trombin hasítási helyétől 3 aminosavra található. Epidemiológiai tanulmányok alapján e polimorfizmusnak védőhatást tulajdonítanak az artériás thrombózissal szemben, bár a polimorfizmus biokémiai háttere még nem tisztázott. Kifejlesztettünk egy HPLC technikát a FXIII-ból trombin hatására lehasadó aktivációs peptidek elválasztására és kvantitatív meghatározására. Molekuláris genetikai módszerekkel azonosított vad típusú, heterozigóta ill. homozigóta egyedek plazmájából és thrombocytájából tisztított FXIII-at különböző ideig kezeltünk trombinnal, a reakciót forralással állítottuk le és a felülúszót HPLC-vel (15%-30% acetonitril gradiens) 210 nm-en analizáltuk. A vad típusú Val34 AP és a mutáns Leu34 AP jól elválaszthatók, a retenciós idők: 17.71, ill. 21.31 min. A heterozigóta típusnál mind a két AP lehasad, a kromatogramon mindkét csúcs látható. A Leu34 AP szignifikánsan gyorsabban hasad le, mint a vad típusú Va134 FXIII-AP. A módszert teljes plazmára is adaptáltuk. A plazmából a fibrinogént bentonittal távolítjuk el, a FXIII tartalmú frakciót ammóniumszulfáttal csapjuk ki. A feloldott fehérjét gélfiltrációt követően trombinnal kezeljük. A HPLC-vel elválasztott AP-eket 210 és 280 nm-en diódasoros LTV-detektorral azonosítjuk. A HPLC-vel, ill. molekulárbiológiai módszerrel történő genotípus meghatározás teljes egyezést mutatott.
Kimutattuk, hogy a véralvadás XIII-as faktorának (FXIII) A alegységében található, az artériás trombosisok ellen védőhatással rendelkező Val34Leu polimorfizmus jelentősen felgyorsítja az aktivációs peptid trombin által történő lehasítását. A Leu34 allél trombin által történő gyorsabb hasítása a FXIII gyorsabb aktiválódásával is jár. Heterozigóták esetében az aktiváció sebessége a vad típusú és a homozigóta mutáns között van. A gyorsabb aktiválódás gyorsabb fibrin keresztkötést is eredményez. A Val-Leu cserének az aktiváció sebességére gyakorolt hatása - molekula modellezési eredményeink szerint a mutáns szubsztrát trombinhoz való nagyobb affinitásával magyarázható. Bár az aktiváció sebességében több mint kétszeres a különbség a mutáns és a vad típus között, trombinnal és kalciummal történő teljes aktiválást követően nincs különbség az egyes genotípusok specifikus transzglutamináz aktivitásában. Teljes plazma FXIII koncentrációját és aktivitását egy lépéses ELISA technikával, ill. optimalizált kinetikus fotometriás módszerrel meghatározva a kalkulált specifikus aktivitás szintén nem mutatott különbséget az egyes genotípusokban és a specifikus aktivitások Gaussi eloszlást mutattak a referencia egyének között. A Val34Leu polimorfizmus FXIII aktivációra kifejtett hatása különösen aláhúzza FXIII aktivitás mérése esetében a trombinnal való telítés fontosságát. Az irodalomban leírt és a kereskedelemben kapható, FXIII mérésére szolgáló módszerek egy jelentős részében a megadott trombin koncentráció mellett Val34 vad típus esetében nem történik meg a FXIII teljes aktiválása, ami lényeges alámérést eredményez.
Endotheliális sejtek egészséges egyének vérében csak véletlenszerűen mutatható ki és valószínűleg apoptotikus sejtek. Akut coronaria syndromás betegek (AMI, instabil angina) vérében viszont relatív nagy számban kimutathatók (5 -7 sejt/ml) és jelenlétük minden bizonnyal endothél károsodásra utal.
Jelen dolgozat egy olyan immunhisztokémiai módszert mutat be, amely alkalmas keringő endotheliális sejtek kimutatására perifériás vérből (buffy coat).
Citrátos vér buffy coat-jának üledékéből kenetet készítünk. Az endogén peroxidáz bénítása után a keneteket polyclonális anti - vWF (DAKO) antitest megfelelő hígításával (1:300) 1 órát inkubáljuk majd mosás után a DAKO LSAB (Labelled Streptavidin - Biotin) kittel, amely megfelelő jelamplifikációt biztosít, láthatóvá tesszük a reakciót. A kit biotinilált második antitestet HRP-vel conjugált streptavidint és DAB szubsztrátumot tartalmaz. Giemsa ráfestés után a keneteket fénymikroszkóppal vizsgáljuk.
Értékelés: a vérben keringő szokványos sejtek közül csak a thrombocyták festődnek, de ezeket méretük alapján könnyű elkülöníteni. Az endotheliális sejtek élénk festődésük alapján könnyen felismerhetők.
Bár a módszer nem ad számszerű eredményt, bizonyos gyakorlattal a sejtszám becsülhető (a leucocyták számához viszonyítva vagy kis nagyítás mellett a látóterenkénti átlagos sejtszámot megadva). A pozitív esetekben pontosabb, de nyílván drágább és nem mindenütt elérhető módszerrel a számlálást meg lehet ismételni.
Debreceni Egyetem Orvos-és Egészségtudományi Centrum, III. sz. Belgyógyászati Klinika, Gyermekklinika
Számos szisztémás autoimmun betegségben, elsősorban szisztémás lupus erythematosusban (SLE), szisztémás sclerosisban és vasculitisekben endothel elleni autoantitesteket (AEA) mutattak ki. Ugyanakkor elsősorban SLE-ben gyakori az antifoszfolipid antitestek jelenléte, amelyek valójában foszfolipidhez kötődő plazmaproteinek, leggyakrabban ß2-glikoprotein I (ß2-GPI) ellen irányulnak, és thrombosissal társulnak. Néhány irodalmi adat szerint ezen két antitestpopuláció rokonságban áll egymással. Munkánk során 48 olyan, SLE-ben szenvedő beteg szérumában vizsgáltuk meg az endothel és a ß2-GPI elleni antitestek jelenlétét ELISA módszerrel, akiknek a kórtörténetében artériás és/vagy vénás thrombosis szerepel. IgG típusú AEA-t találtunk 27 beteg szérumában, míg IgG ill. IgM típusú anti-ß2-GPI antitestet 17, ill 1 S mintában. Az IgG AEA antitestek előfordulása gyakoribb volt az anti-(32-GPI pozitívak (13/27), mint az anti-(32-GPI negatívak között (4/21), bár ez az összefüggés nem volt szignifikáns (p=0,06). Ugyanakkor nem találtunk összefüggést az AEA és a ß2-GPI elleni antitestek szintje között (t=0,055; p=0,7). Anyagunkban 11 olyan SLE-s beteg volt, aki AEA pozitív volt, de sem IgG, sem IgM típusú anti-ß2-GPI ellenanyaggal nem rendelkezett. Közülük 3 lupus anticoagulans pozitív volt, de 8 betegnek semmilyen antifoszfolipid antitestje nem volt. Vizsgálataink szerint: 1. Azon SLE-s betegek nagy része, akinek anamnézisében thrombosis szerepel, endothel elleni antitest pozitív. 2. Az AEA és az anti-ß2-GPI antitestek különböző antitest-populációba tartoznak, bár együttes jelenlétük gyakori. 3. Az SLE-s betegek thrombosis rizikójának megítélése során az AEA jelenlétét is vizsgálni kellene.