It is well known that haemodialyzed patients are more susceptibile to parenterally transmitted viruses partially due to immundeficiency and the disregulationof immunsystem. One of the most important infections of those are releated to HIV and hepatatropic viruses, which have an important impact on the patient's life prospect. While we know more and more about the effect of hepatitis C virus on the immunsystem, we don't know much about hepatitis G and the newly described TT virus. Accordig to our work, HCV and HCV+TTV coinfection cause significant changes in the immunregulation, while the TTV and HGV infection alone does not.
Key words: HCV, TTV, HGV, immunregulation
Régóta ismert tény, hogy a hemodializált betegek a megbomlott immunreguláció következtében az immunhiány klinikai tüneteit mutatják jó talajt adva ezzel a transzfúzióval és kontaktinfekcióval átvihető fertőzéseknek. Napjaink kutatási eredményei igazolják, hogy ezek közül a HIV és a hepatotróf vírusfertőzéseknek kiemelt szerepe van, amelyek a betegek életkilátásait nagymértékben limitálják. (1,2) E vírusok terjedése leggyakrabban parenterális úton, például fertőzött vérrel és vérkészítményekkel történik.
Múlt századunkban főként a hepatitis B vírust tették felelőssé a poszttranszfúziós hepatitisek többségéért. Az 1980-as évek végén bizonyossá vált, hogy a korábban önálló entitásként nyilvántartott non-A, non-B hepatitisek hátterében a hepatitis C vírus (HCV), mint újonnan felfedezett kórokozó áll. (3,4) Az 1990-es években a hepatotróf vírusok családja újabb képviselők felismerésével szaporodott, amelyek közül napjaink ez irányú kutatásainak középpontjában a hepatitis G vírus (HGV) áll. (5,6) A HGV a HCV-vel rokonságot mutató, de attól filogenetikailag és biokémiailag is különböző RNS tartalmú flavivírus. (7) Mára egyértelművé vált, hogy a korábban HGBV/C-ként nyilvántartott vírus azonos a HGV kórokozóval. E vírus prevalenciája egészséges amerikai véradó populációban hozzávetőleg 1,5%. Ez az arány polytranszfundált betegekben akár húszszoros is lehet. (8,9) Annak ellenére, hogy többféle hepatitisben szenvedő betegben azonosították, a HGV klinikai jelentősége napjainkban sem tisztázott. (10,11,12)
A világon elsőként japán kutatók írtak le 1997-ban egy újabb hepatospecifikus ágenst: az egyszálú DNS-t tartalmazó TT vírust. (13,14) Ez a vírus a parvoviridae családba tartozó kórokozó. Jelenleg két szerotípusa ismert. Egészséges véradókban a prevalenciája 1,9%. (15,16,17) Folyamatosan vérre és vérkészítményre szoruló betegeknél ez az arány az 50%-ot is elérheti. E kórokozót is több hepatitises beteg szérumában kimutatták, azonban gyakorlati jelentőségéről még a HGV-nél is kevesebb ismerettel rendelkezünk. Az újabb kórokozók felismerése arra ösztönözte a gyakorlati szakembereket, hogy mind több információt szerezzenek ezen vírusok terjedési módjáról, virulenciájáról, klinikai jelentőségéről. Tekintettel arra, hogy a rendszeresen vérre és vérkészítmények adására szoruló betegek között a hemodializált betegek az első helyen szerepelnek, szükségesnek éreztük, hogy behatóbban foglalkozzunk ezen vírusok immunregulációra kifejtett hatásainak elemzésével hazai HD populációban.
Vizsgálatainkban az ország négy FMC Dialízis Állomásán konvencionális hemodialízissel (HD) kezelt 435 beteg vett részt. A betegeknél első lépésként a perifériás vérből anti-HCV antitest kimutatását végeztük el harmadik generációs ELISA tesztekkel (DiaSorin). A 437 beteg közül 33 bizonyult anti-HCV pozitívnak (8%). A továbbiakban ezen betegek vettek részt vizsgálatainkban_amelvekhez 27 anti-HCV negatív beteget választottunk ?negatív kontrollként, ügyelve arra, hogy az életkor, nem és a fő expozíciós tényezők (HD kezelés tartama, transzfúziók száma, etc.) tekintetében az anti-HCV pozitív populációnak megfelelő legyen. A sejtfelszíni antigének, valamint a cytokin vizsgálatoknál a kapott értékeket az egészséges populációban mért eredményekkel is összevetettük. A vizsgálatok elvégzésének idején a betegeknél egyéb infekcióra utaló klinikai jeleket nem figyeltünk meg. A vizsgálatokhoz perifériás vért használtunk, amelyet minden esetben a dialízis kezelés megkezdése előtt az AV fisztula punkciójával nyertünk. A klinikai kémiai vizsgálatokhoz natív vért vettünk. amelyet lecentrifugálás után feldolgozásig -20ĂC-on tároltuk. Az intracitoplazmatikus cytokinek meghatározását Na-heparint tartalmazó BD Vacutainer csövekbe vett vérből végeztük.
A replikálódó HCV-t Roche Amplicor PCR teszttel végeztük gyártó által megadott protokoll szerint. A hepatitis G vírus és TT vírus kimutatása kétlépéses nested- és seminested PCR reakcióval történt. A vizsgálatokhoz a betegektől szérum mintákat nyertünk, melyet feldolgozásig -20°C-on tároltunk. Nukleinsav preparálás: A virális nukleinsavat 160 ml szérumból nyertük, melyhez 4 ml 20 mg/ml proteináz K-t és 395 ml proteináz digestion puffert (25 mM EDTA, 0,2 M Tris-HCl pH=7,5 0,3 M NaCl, 2% SDS) adtunk. Ezt követően történt a deproteinizáció 37°C-on fenol/kloroform elegyével. A nukleinsavat izopropanollal precipitáltuk és 8 ml bidesztillált vízben szuszpendáltuk. (18) cDNS szintézis a HGV RNS detektálására: A reverz transzkripcióhoz 2 ml reszuszpendált RNS-t adtunk 18 ml reakció elegyhez. (2 ml 10x Perkin Elmer PCR puffer, 3 ml desztillált víz, 8 ml 10 mM dNTP, 1 ml murine leukemia vírus reverz transzkriptáz, 1 ml RN-asin, 1 ml random hexamer). Outer PCR: Az irodalomban korábban leírt primereket használtuk a PCR reakcióhoz. (19,20) A reakcióhoz 50 ml mintát mértünk be, amely 100 ng tisztított DNS-t, 20 pmol primert és 0,2 mM dNTP-t tartalmazott. A PCR reakcló leírását és a primerek szekvenciáit a táblázat tartalmazza. Inner PCR: A HGV RNS kimutatásához nested PCR reakciót, míg a TTV kimutatásához seminested PCR-t használtunk. Az outer PCR termékének 1 ml-ével végeztük a második erősítést.
A továbbiakban az alábbi vizsgálatokat végeztük el: karbamid-N, kreatinin, összfehérje, ALP, bilirubin, gammaGT, GOT, GPT, ELFO, IgG, IgA, IgM, Waaler-Rose, ANF, ANCA, anti-kardiolipin, béta-2 glycoprotein, AMA, SMA, LKM, CD3, CD4, CD8, CD19, CD6, HLA-DR CD69, szolubilis: IL-2, IL-6, gamma-IFN, IL-4, 1L-10, IL-13, TNF-alfa, TGF-bétal, intracelluláris: gamma-IFN, IL-4, IL10.
A klinikai kémiai vizsgálatokat szokványos klinikai kémiai reagensekkel, IFCC módszer szerint, ILab 300 kémiai analizátorral végeztük. Az immunglobulin szintek meghatározása nefelometriás módszerrel történt. Az ELFO vizsgálatokat Sebia Hydrasys rendszerrel végeztük. A szerológiai vizsgálatokhoz és a szolubilis cytokinek szintjének méréséhez sandwich ELISA módszert alkalmaztunk a gyártók által megadott protokollok szerint. Az anti-nucleáris faktor (ANF) kimutatása indirekt immunfluoreszcens módszerrel, Hep2 sejtkultúrákon történt. A további autoantitest kimutatásokat patkány máj és vese szöveteken indirekt immunfluoreszcenciás módszerrel végeztük. A sejtfelszíni CD antigének és az intracelluláris cytokinek azonosítását monoklonális ellenan~yagok segítségével, direkt immunfluoreszcenciás módszerrel végeztük. A vizsgálatok értékelése EPICS Coulter flow cyrtometerrel történt.
A vizsgálati eredmények statisztikai elemzése Student féle kétmintás T próbával történt.
A viraemia alapján betegeinket több csoportba osztottuk. Kontrollként (negatív) azon HD betegek szerepeltek, akiknél PCR reakcióval egyik vírus jelenlétét sem találtuk. Az életkor, transzfúziók száma és a hemodialízisben töltött idő összefüggését a viraemia típusával az 1. táblázat tartalmazza.
|
1. táblázat Klinikai adatok
|
A KN, kreatinin, összfehérje, ALP, bilirubin és gamma-GT értékekben az egyes csoportok között eltérést nem találtunk. Szignifikánsan emelkedett GOT és GPT értékeket mértünk azonban a HCV és HCV+TTV pozitív betegeknél. (1. ábra) Ezen populációkban, valamint a HGV+TTV betegek szérumában gyakrabban figyeltünk meg polyclonalis gamma szaporulatot. Az ELFO képnek megfelelően ezen betegcsoportokban mértük a legmagasabb IgG szinteket is (2. ábra). A szérum IgA és IgM szintekben eltérést nem tapasztaltunk. Az autoantitestek közül a HCV pozitív betegeknél magasabb arányban fordult elő reuma faktor (RF) és ANF pozitivitás. A TT vírussal szövődött HCV infekcióban szignifikánsan magasabb anti-kardiolipin IgG és anti-béta-2 glycoprotein IgG szinteket mértünk (3,4. ábra). A CD4 pozitív sejtarány a HCV és HCV+TTV csoportokban jelentős csökkenést mutatott, mely az utóbbi esetben szignifikáns volt. (5. ábra) Ezzel korrelálva e két populációban a CD8 pozitív sejtek szignifikáns emelkedése volt me~figyelhető. (6. ábra) A CD3 és CD19 pozitív sejtek arányaiban nem találtunk eltérést az egyes populációk között. Minden hemodializált csoportban jelentősen emelkedett azonban a CD3/HLA-DR és CD3/CD69 pozitív sejtek aránya az egészségesekhez képest. A CD3/HLA-DR sejtek számának további emelkedése figyelhető meg a HCV és HCV+TTV csoportokban. (7. ábra)
1. ábra
2. ábra
3. ábra
4. ábra
5. ábra
6. ábra
7. ábra
A szolubilis IL-2 és IL-6 szintje minden HD csoportban magasabb volt, mint az egészségesekben. (8. ábra) Az egyes viraemia típusok ezen emelkedésre nem voltak hatással. Az IL-13 szintje minden populációban csökkent az egészségesekhez képest. (9. ábra) A CD4 pozitív lymphocyták intracelluláris gamma-IFN szintje minden HD populációban -nem szignifikáns mértékben ugyan, de -magasabb volt, mint az egészségesekben. (10. ábra) Ennek megfelelően az ic. IL4 szintek az egészségesekhez képest jelentős csökkenést mutattak. (11. ábra) A szolubilis cytokinekhez hasonlóan az intracelluláris cytokinek szintje sem mutatott összefüggést az egyes viraemia típusokkal.
8. ábra
9. ábra
10. ábra
11. ábra
Míg a hepatitis C vírusnak az immunregulációra kifejtett hatásáról több információval rendelkezünk, addig az újonnan felfedezett vírusokról - különösen a TT vírusról - ez nem mondható el. Ezért vizsgáltuk a viraemia hatását a hemodializált betegek immunregulációjára. Szükségesnek találtuk ezt azért is, mert az irodalomban - különösen az újabb vírusok tekintetében - sokszor hiányos, egymásnak ellentmondó adatok jelennek meg. Munkánkkal is igazoltuk, hogy a HCV és társult infekciói a hepatospecifikus biokémiai paraméterek (GOT, GPT) emelkedését okozzák. TT és HG vírus, tünetmentes krónikus vírushordozó betegekben nem eredményez kimutatható enzimemelkedést. A direkt máj károsító hatásukon kívül ezen vírusoknak jelentős a szisztémás immunrendszerre kifejtett hatása. Mindhárom vírusinfekció, illetve ezek koinfekciói polyclonalis gammopathiát eredményeznek, melynek hátterében a fokozott IgG produkció áll. A HCV és a HCV+TTV koinfekciója fokozza az autoantitest termelést, amely főként RF, ANF és anti-kardiolipin produkciót jelent. Ezen túlmenően a celluláris immunszisztéma megbomlása is igazolható HCV és HCV+TTV infekció esetén. E két fertőzés a helper T lymphocyták %-os arányának csökkenése mellett a CD8 pozitív cytotoxikus sejtek arányának emelkedését okozza. (E jelenség a TTV és HGV egyedüli előfordulása esetén nem figyelhető meg.) A HD kezelés önmagában is jelentős korai (CD3/CD69) és késői (CD3/HLA-DR) típusú sejtaktiválódáshoz vezet. A késői típusú sejtaktivációt a HCV és TTV-vel való koinfekciója potencírozza Az aktiváció mellett a HD betegekben a Th1/Th2 arány megbomlása figyelhető meg, ami jelentős Th1 túlsúly képében jelentkezik. Munkánk során fokozott szolubilis IL-2 (Th1) produkciót és csökkent IL-13 (Th2) termelést figyeltünk meg minden hemodializált betegben, függetlenül a viraemia típusától. A szolubilis IL-4 és IL-10 értékekben eltérő eredményeket kaptunk. A HCV és HCV+TTV csoportokban várakozásunkkal ellentétben magas IL-4 és IL-10 szinteket mértünk, ami magyarázhatja ezen betegek erőteljesebb IgG termelését. Feltételezésünk szerint e megfigyelés hátterében nem lymphoid sejtek fokozott Th2 cytokin termelése állhat, mely a nagymértékben megbomlott Th1/Th2 arányt hivatott kompenzálni. A CD4 pozitív sejtek cytokin mintázata a korábban megfigyelt Th1/Th2 regulációjának megbomlását teljes mértékben igazolta. Az egyes viraemia típusok között itt sem találtunk azonban szignifikáns eltérést.
Összességében megállapítható, hogy a HCV és TTV-vel való koinfekciója a májfunkció kimutatható romlását eredményezi. Megfigyelhető továbbá ezen betegek polyclonalis gammopathiája amit a fokozott IgG termelés eredményez. E betegcsoportban fokozottabban kell számolni autoantitest termelés megjelenésével. Ezen változásokon túl a celluláris immunreguláció zavara is kimutatható, ami nem tudható be egyedül a HD kezelésnek, hiszen további fokozott cytotoxikus reakció és késői típusú sejtaktiváció figyelhető meg a HCV és HCV+TTV koinfekciókban. Annak ellenére, hogy a HD kezelés következményeként megfigyelhető Th1/Th2 arányeltolódást az egyes vírusok perzisztenciája nem befolyásolja, úgy tűnik, hogy a HCV infekció önmagában és TTV-vel való koinfekciójában jelentős szisztémás változásokat idéz elő az immunregulációban. Ezzel szemben a TTV és HGV önmagában kevésbé játszik szerepet ilyen irányú folyamatokban.
Munkánkat az FMC Dialízis Center Kft pályázati támogatásával készítettük el, amelyért ezúton is köszönetünket fejezzük ki.
Picciotto A, Varagona G,
Gurreri G, et al.: Anti-hepatitis C virus antibodies and hepatitis C virus
viraemia in haemodialysis patients.
Nephrol Dial Transplant 1993; 8: 1115-1117
Pereira BJ, Levey AS: Hepatitis
C virus infection in dialysis and renal transplantation.
Kidney Int 1997; 51: 981-999
Brechot C: Hepatitis C virus: molecular biology and genetic variability. In: Schmid R et al. eds: Acute and chronic hepatitis. Kluwer Academic Publ. Dordrecht, Boston, London. 1995; 35-56
Bukh J, Miller RH, Purcell RH:
Genetic heterogenity of hepatitis C virus: quasispecies and genotypes.
Seminar in Liver Dis. 1995; 15: 41-63
Linnen J, Wages J Jr,
Zhang-Keck ZY: Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus:
A transfusion transmissible agent.
Science 1996; 271: 505-508
Simmons JN, Leary TP, Dawson GJ
et al: Isolation of novel virus-like sequences associated with human
hepatitis.
Nature Med 1995; 1: 564-569
De lamballiere X, Charrel RN,
Dussol B: Hepatitis GB virus C in patients on hemodialysis.
N Eng J Med 1996; 334: 1549
Okamoto H, Nakao H, Inoue T et
al: The entire nucleotide sequence of two GB virus C/hepatitis G virus
isolates of distinct genotypes from Japan.
J Gen Virol 1997; 78: 737-745
Masuko K, Mitsui T, Inane K et
al: Infection with hepatitis GB virus C in patients on maintenance
hemodialysis.
N Eng J Med 1996; 334: 1485-1490
Heringlake S, Osterkamp S,
Trautwein C et al: Association between fulminant hepatic failure and a strain
of GBV virus C.
Lancet 1996; 348: 1626-1629
Pessoa MG, Terrault NA, Detmer
J et al: Quantitation of hepatitis G and C viruses in the liver: evidence that
G virus is not hepatotropic.
Hepatology 1998; 27: 877-880
Yoshiba M, Okamoto H, Mishiro
S: Detection of the GBV-Chepatitis virus genome in serum from patients with
fulminant hepatitis of unknown aetiology.
Laf~cet 1996; 346: 1131-1132
Nishizawa T, Okamoto H, Konishi
K et al: A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels
in posttransfusion hepatitis of unknown etiology.
Biochem Biophys Res Commun 1997; 241: 92-97
Okamoto H, Nishizawa T, Kato N
et al: Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV)
associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology.
Hepatology Res 1998; 10: 1-6
Simmonds P, Davidson F, Lycett
C et al: Detection of a novel DNA virus (TTV) in blood donors and blood
praducts.
Lancet 1998; 352: 191-195
Oguchi T, Tanaka E, Orii K et
al: Transmission of and liver injury by TT virus in patients on maintenance
hemodialysis.
J Gastroenterol 1999; 34: 234-240
Yuki N, Kato M, Masuzawa M et
al: Clinical implications of coinfection with a novel DNA virus (TTV)
hepatitis C virus carriers on maintenance hemodialysis.
J Med virol 1999; 59: 431-436
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Sprig Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. USA, 1989
Naumov TV, Petrova EP, Thomas
MG, Williams R: Presence of a newly described human DNA virus (TTV) in
patients with liver disease.
Lancet 1998; 352: 195-197
Khudyakov YE, Cong ME,
Bonafonte MT et al.: Sequence variation within a nonstructural region of the
hepatitis G virus genome.
J Virol 1997; 72: 6875-80
* Levélcím: Dr. Fodor Bertalan
FMC Miskolci Nefrológiai Központ
Klinikai Diagnosztikai Laboratóriuma
3501 Miskolc, Szentpéteri kapu 76.