Szegedi Tudományegyetem, Általános Orvoskar, Központi Klinikai Mikrobiológiai Laboratórium, Szeged
Az anaerob baktériumok által okozott humán infekciók laboratóriumi diagnosztikája egyike a rutin bakteriológiai vizsgálatok legmunkaigényesebb és legidőigényesebb területeinek. Az elmúlt évek során hazánkban jelentős erőfeszítéseket tettünk ennek a területnek a fejlesztése érdekében, elméleti és gyakorlati oktatások szervezésével, a megfelelő szintű munkát segítő laboratóriumi berendezések elterjesztésével. Mégis úgy tűnik, hogy kevés az a szakember aki a meglehetősen bonyolult és sokszor az átlagnál nagyobb kitartást igénylő feladatra vállalkozik. Az OEK által összeállított 1998 évi értékelésében külön kiemelésre került, hogy a jelentést küldő laboratóriumok által anaerob irányba is feldolgozott mintákból (52325) csak meglehetősen kis számú (8144) anaerob baktérium izolálására került sor. Az előadásban az anaerob baktériumok izolálási esélyeit befolyásoló tényezők mellett ismertetjük azt az egyszerű identifikálási sémát, melyet az anaerob referencia laboratórium alkalmaz és értékeljük e módszerrel kapott eredményeinket mind az 1999 során izolált és identifikált 1080 klinikai rutin anyagból származó anaerob izolátum esetében, mind pedig az 1400 további a laboratórium által végzett kutató munka során izolált anaerob törzs esetében. A módszer a telepmorfológia, fáziskontraszt és Gram-festett kép mellett a növekedési faktorok, a presumptiv rezisztencia adatok és néhány könnyen kivitelezhető biokémiai próba (indol, nitrát, oxidáz, kataláz, ureáz) alkalmazásával számos humán pathogén izolátum species vagy genus szinten történő azonosítását teszi lehetővé.
1ZIPPER Kft. Szeged,
2Szegedi Tudományegyetem, Központi Klinikai Mikrobiológiai Intézet
A papillomavírusok rendszertanilag a papovavírusok családjába tartoznak. A víruspartikulumok 52-55 nm átmérőjű icosahedrális részecskék. Fő szerkezeti fehérjéjük az L1 jelű kapszid fehérje, amely alapján egyébként az altípusok szerológiai elkülönítése történik. Genetikai állományuk, vagyis genomjuk kb. 8 kilobázis méretű, cirkuláris duplaszálú DNS molekula.
A papillomavírusok epitheliotropizmussal rendelkeznek. Ezen belül azután két fő csoportot különböztethetünk meg. A mi érdeklődésünk középpontjában a mucosális típusú vírusalfajok közül a HPV 16-os került, ugyanis ez az az altípus, amely a leggyakrabban okoz cervikális karcinomát. Meg kell említenünk azt az elvet, hogy a HPV altípusok aszerint vannak High risk, Immediate risk és Low risk alcsoportba osztva, hogy milyen gyakorisággal okoznak rákos elfajulást. Így a High risk csoport legeklatánsabb képviselője a HPV 16 és HPV 18.
Számos irodalmi adat alapján tudjuk a HPV 16-ról, hogy szoros összefüggés van a 16-ossal való fertőzöttség és a cervikális carcinoma előfordulása között, amely kialakulása két virális és két celluláris, azaz sejteredetű fehérje kölcsönhatása miatt következik be.
Megfigyelések szerint a celluláris p53 fehérje 72. aminosavának milyensége meghatározza a cervixrák előfordulásának gyakoriságát. Így elmondhatjuk, hogy azokban az egyénekben, akiknél a p53 72-es helyén Arginin van kódolva fokozottan fordul elő - HPV-vel történő fertőzöttség esetén - a cervix karcinoma.
A jelenleg használt HPV L1 szekvencián alapuló diagnosztizálás mellet, vagy akár helyett javasoljuk a vírus E6 szekvenciája alapján történő tipizálást és egyidejűleg az egyén p53 genotípusának megállapítását.
SzTe. ÁOK, KKML Szeged
A leggyakoribb biofilmképző kórokozóknak mind ezideig az Enterobecter spp. S. epidermidis, P. aeruginosa, E. coli, G. vaginalis, Lactobacillus spp., anaerob baktériumok valamint a Candida albicans bizonyultak. A szervezetben lévő ún. idegen anyagok, sérült szövetek, bioanyagok predilekciós helyei a biofilm képződésnek: katéterek, kanülák, műanyagalapú implantátumok, szemészeti műlencsék, fogkoronák, fogművek, traumatológiai lemezek, csavarok, szegecsek, izületi protézisek, intrauterin fogamzásgátló eszközök (IUD), epe és vesekövek. Ezen baktériumok általában nagyobb rezisztenciát mutatnak in vivo a gazdaszervezet védekező mechanizmusával, fagocytosissal és az in vitro érzékenységet mutató antibiotikumokkal szemben.
Centrális vénás katétereket adszorpciós felületként alkalmazva, klinikai mintákból izolált C. albicans törzsekkel végeztünk modellkísérletet a biofilm képzés vizsgálatára, melynek detektálását confocalis laser scanning mikroszkóppal (CLSM) végeztük. Az in vivo képződött biofilm vizsgálatát IUD eszközökön vizsgáltuk, kiegészítve aerob, anaerob, gomba és mycoplasma irányú tenyésztési eljárásokkal. Kettős festési eljárás (FITC-el jelölt concanavalin-A, O-safranin) alkalmazásával a CLSM technika a kórokozó, ill. az általa képzett biofilm elkülönítését teszi lehetővé térhatású felvételeken.
1 Szegedi Tudományegyetem, Központi Klinikai Mikrobiológiai Laboratórium, Szeged
2 Dept. of Parasitology, Natl. Institute of Infectious Diseases, Tokyo, Japan
A legionellák a bakteriológiai pneumóniák jelentős etiológiai ágenseit képezik. A Legionella (L) pneumophila olyan fakultatív intracelluláris parazita, amely mind a humán monocytákban, mind az amoebákban képes megállni. Az az általános feltételezés, hogy legionellosis akkor fordul elő, amikor élő legionellákat tartalmazó aerosolt lélegzünk be az alsó légúti traktusba és ez alkalmanként pneumoniát okoz. A legionellosis megelőzéséhez és ellenőrzéséhez ki kell mutatni és vizsgálni kell a legionellákat a környezetben (pl. tavakban, vízfolyásokban, vízellátó rendszerekben és hűtőtornyokban). A tenyésztési módszereknek megvannak a maguk korlátai (hosszú inkubációs periódus, a 100 %-osnál kisebb kimutathatósági arány), ezért labordiagnosztikai módszereink továbbfejlesztése céljából PCR módszereket is bevezettünk, olyan primerekkel, amelyek a Legionella genusra (5S rRNS gén), illetve a L. pneumophilára (mip gén) specifikusak. Általunk beoltott vízmintákat,illetve BAL-ból származó klinikai izolátumokat vizsgálva azt találtuk, hogy a legionellák 5S rRNS génjének 108-bp fragmentumát alkalmazó PCR akkor képes kimutatni a legionellákat a szimulált mintákból, ha azok 10 cfu/ml-t tartalmaznak. A PCR előnye az, hogy egy nap alatt eredményt ad, szemben a szokványos tenyésztési módszerekkel. Ez gyors antimikrobiális terápia megindítását teszi lehetővé. A PCR módszer bevezetése mellett nem lehet azonban mellőzni a megszokott tenyésztési módszereket. Először is, a PCR érzékenységét (szemben a megszokott tenyésztési módszerekkel) nem lehet fokozni a minta mennyiségének növelése révén, mert PCR inhibitorok lehetnek a mintában. Másodszor ez a módszer csak igen-nem választ, de legjobb esetben is legfeljebb szemikvantitatív eredményt képes adni. Ugyanazt a mintát tehát tenyésztési módszerekkel is meg kell vizsgálni, hogy kvantitatív adatokat és epidemiológiai tipizálásra szolgáló törzseket is nyerhessünk. Következésképpen, a PCR és a tenyésztési módszerek kiegészítik, de nem helyettesítik egymást a vízminták ellenőrzésében és a klinikai diagnózis felállításában.
Országos Epidemiológiai Központ, Virológiai Főosztály
A mononucleosis infectiosa differenciál diagnosztikájában az Epstein-Barr vírus különböző antigénjei, mint a VCA (vírus kapszid antigén), EAD (korai antigén D komponense), EBNA (nukleáris antigén) elleni ellenanyagok vizsgálata alapvető szerepet játszik. Ezen antigének előállítása EBV-t hordozó sejtvonalakból az immunfluoreszcens vizsgálatokhoz laboratóriumunkban megoldott. Továbbá számtalan, kereskedelmi forgalomban lévő ELISA kit is rendelkezésre áll ezen antigénekkel szembeni reaktivitás vizsgálatára. A heterophil ellenanyag negatív esetekben cytomegalovírus fertőzés is szerepelhet kóroki tényezőként. Ennek vizsgálata is leggyakrabban IF módszerrel vagy ELISA módszerrel történik, saját vagy kereskedelmi forgalomban lévő kitekkel. A klinikai kép alapján indokolt komplex ellenanyag-vizsgálatok kivitelezésének fő nehézségét azonban legtöbbször a vizsgálatok időbeli kivitelezése adja.
Vizsgálatainkban egy olyan új módszert hasonlítottunk össze hagyományos módszerekkel végzett ellenanyag-vizsgálatok eredményeivel, mely lehetőséget ad ezen komplex ellenanyag-vizsgálatok gyors elvégzésére.
Az új módszer, a Copalis technika alapja a lézerfény szóródásán alapuló részecskeszámlálás. A vizsgálatban használt antigén (pl. tisztított vírus vagy a vírus rekombináns technikával előállított antigénjei) mikropartikulákhoz kötöttek, ezek agglutinálódnak a létrejövő immunológiai reakció, a savómintában található specifikus ellenanyagok antigénhez kötődése során. Az agglutinálódott és agglutinálatlan mikropartikulák részecskeszámlálással elkülöníthetők a lézerfény eltérő mintájú szóródása alapján. A vizsgálatokat az Epstein-Barr vírus (EBV) és a cytomegalovirus (CMV) 3 különböző antigénje ellen termelődött ellenanyagok meghatározásával végeztük. A Copalis technikával elvégzett vizsgálatok eredményeit ELISA (Gull, Behring) és LF (saját) vizsgálatok eredményeivel vetettük össze.
Jelen vizsgálatunkban 100 olyan savót vizsgálatunk, melyek rutin vizsgálatra érkeztek laboratóriumunkba, akiknél vezető diagnózisként mononucleosis szerepelt.
A kapott eredmények azt mutatták, hogy az új módszer segítségével az EBV és a CMV különböző antigénjeivel szembeni reaktivitás vizsgálata jó egyezést ad a hagyományos módszerekkel végzett vizsgálatokkal és lehetőséget ad a klinikai diagnózis megbízható megerősítésére vagy kizárására. Ezen túlmenően, mivel a komplex vizsgálatok rövid időn belül elvégezhetők, nemcsak megbízható laboratóriumi hátteret biztosít a klinikusoknak, de az eredmények rövid időn belül rendelkezésre állnak.
A hibridizációs és amplifikációs módszerek technikai egyszerűsödése, a kereskedelmi forgalomban beszerezhető diagnosztikus kitek megjelenése a módszereket sok, korábban molekuláris biológiai tapasztalattal nem rendelkező mikrobiológiai diagnosztikai laboratórium számára elérhető közelségbe hozta. Mára e módszerek kétség kívül polgárjogot nyertek a mikrobiológiai diagnosztikai eljárások fegyvertárában. Fajlagosságuk, és különösen a célszekvenciák amplifikációján alapuló módszerek érzékenysége messze meghaladja a hagyományos, tenyésztésen alapuló eljárások teljesítményét.
A jelenlegi - még alakuló - finanszírozási rendszer számos diagnosztikai eljárást jelentősen alul-finanszíroz. Így a laboratórium érdekeltté válhat olyan módszerek választásában (pl. molekuláris módszerek), melyek finanszírozása nem, vagy kevésbé irreális. A diagnosztikai megközelítés ilyen alapon történő tervezése azonban veszélyeket rejt magában. A módszerek személyi, de különösen infrastrukturális igényei (pl PCR esetén három légzsilipes, egymástól izolált helyiség külön személyzettel és eszközökkel) igen magasak, és a hazai laboratóriumok döntő többségében nem állnak rendelkezésre. A problémát bonyolítja, hogy bár a belső kontrollok rendszere a módszerekre jól kidolgozott, gyakorlatilag megoldatlan a molekuláris mikrobiológiai diagnosztika szervezett, külső minőségellenőrzése. További gondot jelent (bár multiplex amplifikációs rendszerek már egyes kórképekre rendelkezésre állnak), hogy e módszerek inkább "kórokozó-", mint "kórkép orientáltak". Azaz az esetek többségében a kórkép (pl. hepatitis, meningitis, diarrhoea) számos lehetséges kórokozója közül egy, vagy néhány kimutatását célozzák meg, nem vizsgálva a többit. Ez különösen olyan esetekben jelenthet gondot, ha a vizsgálatot molekuláris módszerekkel rendelkező, de egyébként nem mikrobiológiai, így konzultatív klinikai mikrobiológiai szolgáltatást nyújtani nem tudó és a hagyományos diagnosztikai módszerekkel nem rendelkező laboratóriumban végzik.
Mindezek alapján, egy laboratóriumnak, mielőtt e módszerek alkalmazását felvállalná, gondosan fel kell mérnie, hogy az eljárás bevezetése az adott szinten szakmailag indokolt-e, gazdaságos-e és a laboratórium rendelkezik-e a szükséges személyi és technikai felkészültséggel a módszerek kivitelezéséhez, és nem utolsósorban az eredmények interpretálásához.
Debreceni Egyetem Orvos- és Egészségtudományi Centrum Mikrobiológiai Intézet
A FUNGITESZT élesztőgombák antifungális szerek iránti érzékenységének meghatározására szolgáló, mikrodiluciós technikán alapuló mikroteszt. Hat féle gombaellenes szert (5-fluorocitozin, amphotericin B, miconasol, ketoconasol, itraconasol, fluconasol) vizsgál kétféle koncentrációban RPMI1640-es táptalajban redox indikátor jelenlétében.
A teszt idén került bevezetésre intézetünk diagnosztikai laboratóriumában tekintettel a szisztémás mikózisok számának ugrásszerű megemelkedésére.
Négy hónap alatt 332 Candida törzset izoláltunk az intézmény beteganyagából: 232 C.albicans, 35 C.glabrata, 19 C.tropicalis, 16 C.parapsilosis, 15 C.kruzei, 15 egyéb. Ezek közül összesen 237 törzsnek vizsgáltuk az érzékenységét FUNGITESZT-tel, Fluconasol és Itraconasol esetében pedig az eredményeket összehasonlítottuk az E-teszttel kapott értékekkel is.
Előadásunkban ezen eredményeinkről szeretnénk beszámolni.