Plasma/serum fructosamine (FA) is an index of human diabetic control. Most of the determinations are based on a colorimetric reaction with nitroblue tetrazolium (NBT).
The aim of this work was to develope a precise, cost (and time) saving method for FA measuring. To produce cost effective self made reagent, the classic method of Johnson et al. (1983) was applied on ELISA microplate. Twenty µL plasma and standard samples are pipetted into the wells in three parallels. After pipetting of 200-200 µL reagents (eight-channel pipette), as well as both incubations (5-5 minutes in 37ºC) A1 and A2 absorbances are measured in automatic microplate autoreader, at 550 nm, and evaluated automatically.
FA concentrations of 39 human samples by the standard macro method (LaRoche kit) were compared with this new micro methode. The correlations (r) were found 0.97 (three parallels) or 0.94 (two parallels) for these samples, and between 0.93-0.97 for similarly determined animal (cattle, dog, rabbit and horse) samples with the two methods. Intra assay reproducibility was 97.5%; inter assay reproducibility was found as 96.2%.
The modified method proved to be from the side of reagents very cost effective (determination of one plasma costs only two hundred part of that by the common laboratory methods). So, the diabetes control of human, as well as the control of carbohydrate metabolism of other mammals can be taken easily and for a greater part of applicants, if necessary.
Bevezetés
A szérum/plazma fruktózamin (FA) koncentrációjának mérése ma már nemzetközi és hazai vonatkozásban is rutinszerűnek tekinthető a humán diabetes kontrolljában, a glikált hemoglobin (HbA1c) meghatározással egyöttesen. A háziállatokra vonatkozó - a cukorbetegség kezelésének nyomonkövetését, ill. a szénhidrátanyagcsere retrospektív monitorozását célzó - mérések is igyekeznek felzárkózni előbbiekhez.
Saját laboratóriumi munkánkban a fruktózamin mérésére évekig megbízhatónak bizonyult a REANAL cég fruktózamin reagens készlete, amely Johnson et al. (1983) eredeti kolorimetriás módszerének módosítása. E mérsékelt árfekvésű teszt hazai forgalmazásának közelmúltban történő megszűnte után más (nemzetközi) cégek jó minőségű, de relatíve drága tesztjei maradtak elérhetőek. A sokféle használt FA metodika közöl a hazai vezető diabetológusok és laboratóriumi szakemberek (Tamás Gy. és mtsai, 1997) ajánlása szerint ma is leginkább a nitrotetraszolium-kék (nitroblue tetraszolium, NBT) reagens alapú, automatizálható, könnyen elvégezhető kolorimetriás módszer ajánlható, amely szintén az eredeti módszeren alapul.
Az eddig használt metodikák "makro módszerek", azaz egy mérés 1000, vagy 2000 µl reagens és 100, vagy 200 µl szérum-, ill. plazmaminta felhasználásával történik, manuális módszerrel, vagy automata mérőműszerrel.
Kézenfekvő volt tehát az a törekvésönk, hogy egy "mikro" módszer kialakításával a reagens szökséglet jelentősen csökkenthető lehessen, és egyben korábbi manuális módszerönket automatizálhassuk. Az ELISA-lemez 96 vájulatában végzett analízissel éppen tizedére csökkenthető az eddig kémcsőben végzett metodika reagens igénye.
Ezért még a REANAL teszt reagensét felhasználva számos vizsgálatot végeztönk az ember és kölönböző állatfajok tömény plazmájából, ill. azok 3:1 és 1:1 hígításából is, a spektrumfelvételt követően a 490-620 nm tartományon belöl több hullámhosszon; valamint hőfokon és relatív időintervallumokkal. A leolvasáshoz rendelkezésönkre állt egy hagyományos nagypontosságú Zeiss fotométer (makro módszer), ill. egy modern ELISA leolvasó (microplate autoreader).
A mikro módszer beállításához heparinnal levett -20ºC-on tárolt humán vérplazmát használtunk. Standard: ismert fruktózamin koncentrációjú plazma, amelynek mérése a HIETE laboratóriumában LaRoche kittel történt. Kontroll: gyűjtött bovin plazma. A mérések ELISA laboratóriumban (ÁOTE) történtek.
A reagenseket illetően alapvetően Johnson (1983) eredeti módszerét alkalmaztuk a következő módon ill. módosításokkal: 50 mg NBT festéket (nitroblue tetrazolium grade III. crystalline, ms. 817,6 g, SIGMA, Lot. Nr. 77H5083) oldottunk 244,6 ml karbonátpufferben (pH=10,11). A puffer készítéséhez (fűthető mágneses keverő segítségével pontosan feloldva) 13,375 g/250 ml (0,5 mol) Na2C03-hoz 2,1 g/50 ml (0,5 mol) NaHCO3-at kevertönk, majd a pontos 10,11 pH értéket szökség esetén 1 n NaOH oldattal állítottuk be (digitális laboratóriumi pH-mérővel: OP-211/1, Radelkis, Budapest ellenőrizve). Az így készölt reagens +4ºC-on tárolva tizenkét hónapig megőrizte sárga színének stabilitását, és reprodukálható mérési eredményeket szolgáltatott.
A mérés saját metodikai fejlesztésönk az alábbiak szerint: 96 szögletes vájulatú ELISA lemez (CEB, France) vájulataiba 20-20 µl plazmát pipettáztunk 3 paralellben hagyományos Finn-pipettával, a négy sarki lyukat öresen hagyva. A standard és gyűjtött bovin plazma mintákat ugyanígy vittök fel. Ez lemezenként 28 mérendő minta FA koncentrációjának meghatározását tette lehetővé.
8 csatornás pipettával minden mérőhelyre felvittönk 200-200 µl reagens oldatot. 5 percig kevertök és inkubáltuk a mintákat 37ºC-on (fűthető rázógép, AMERSHAM), és a kezdeti abszorbanciát (A1) 550 nm-en határoztuk meg automatikus leolvasással (Microplate autoreader, EL 311, Bio-Tek Instruments) és eredményközléssel (Okidata Microline 184 Turbo 9 Pin Printer). Újabb 5 perc hasonló inkubálás után ugyanígy megmértök az A2 értékeket is.
Metodikai beállításunk során 39 humán vérplazma FA értékét határoztuk meg új mikro módszerönkkel, és vetettök egybe a kapott értékeket ugyanezen mintáknak a standard (LaRoche kit) módszerrel nyert eredményeivel.
Az első ábra a vizsgált 39 humán vérplazma kis-, közepes- és nagy FA tartomány szerint csoportosított n=13-13 plazma FA átlagai közötti igen jó megfelelést mutatja ki a két módszernél, az alacsony-, normál-, és magas FA-nal rendelkező (diabéteszes) egyének csoportjai között egyaránt.
A mikro módszer reprodukálhatósága mérési sorozaton belöl 97,5%; mérési sorozatok között 96,2% volt a közepes koncentráció tartományban. Az alacsony és magas koncentrációjú sávban 1-1,5%-nál nagyobb eltérés nem volt.
A második ábra az összes (n=39) humán plazma minta szérum fruktózamin koncentrációiban a LaRoche kit módszerrel és ELISA lemezen végzett új mikromódszerönkkel két paralellben történő mintafelvitellel mutatott szoros korrelációt (r=0,942) (p<0,001), valamint a regressziós egyeneshez való jó illeszkedést ábrázolja és számszerűsíti. Három párhuzamos mérés esetén még szorosabb: 0,972 volt a korreláció.
A sorozatmérés feltétele a minta és a reagens közötti reakcióidő azonosságának biztosítása minden mintánál. Az itt leírt módszernél felhasznált automata leolvasó esetében ez a minta elsődleges bepipettázásával (ez a relatíve lassabb folyamat) volt biztosítható, mivel a reagens felvitele ezután közel egyszerre történt. Ezt biztosítja az automata értékelő is, amely 2-3 sec alatt végigpásztázva értékeli az egyes minták abszorbanciáit, és úgy nyomtatja ki azokat.
Ha kézi (félautomata) mikro (ELISA) leolvasó áll rendelkezésre, ahol az egyes minták abszorbanciáját egymás után lehet értékelni, akkor a minta reagenshez másodikként történő hozzáadását lehet javasolni, így biztosítható az azonos reakcióidő minden vájulatban. Ugyanakkor saját készítésű reagensönk (amely csak néhány kis változtatással tér el az eredeti Johnson féle leírástól, és a reakció kivitelezése is igen hasonló) módot nyújt arra, hogy hagyományos ("makro") kémcsőreakcióban is kivitelezhető legyen a mérés. Ennek során 2000 µl reagenshez 200 µl plazmát egyenként pipettázva az egyszerűbb műszerezettségű, de még fotométerrel rendelkező, kisebb kihasználtságú laboratóriumok számára is elérhetővé válik a FA meghatározása. Ugyanis a reagens (bár urikázt és detergenst nem tartalmaz) normál hűtőben 12 hónapig is színstabilan eláll, tehát folyamatosan használható.
A módszer kivitelezhetőségét emlősállatokon is teszteltök. Az először vizsgált humán minták szoros korrelációja jól egyezett a hasonlóan vizsgált állati minták (szarvasmarha, kutya, nyúl és ló) két módszer közötti r=0,93-0,97 értékeivel.
A módszer hibáját, a reprodukálhatóságot számos módon és alkalommal vizsgáltuk. A mérési sorozaton belöl és a mérési sorozatok között a minták reprodukálhatósága alig tért el. Humán mintákon bizonyítottuk be, hogy a két módszerrel nyert eredmények korrelációs értékei inkább a felvitt mintaparalellek számától föggenek: 3 párhuzamos esetén kaptunk igen szoros, megbízható 0,97 korrelációs értéket, bár a két paralellben történő vizsgálat 0,94-es korrelációs értéke is megfelelő értékelést tesz lehetővé, mégis a 3 párhuzamos minta felvitele ajánlhatóbb.
Megállapítható, hogy az új automatizált mikroeljárás eljárás gyors, pontos, jól reprodukálható és gazdaságos saját reagens használata esetén.
Három paralellben mikro módszerrel (ELISA lemezen) mérve a vegyszerköltség csupán 2%-a az általános (cégek reagens kitjeivel végzett) laboratóriumi teszt módszerekkel történő egyetlen mérésnek (és eszerint a makro kémcsőreakció ára a mikro módszer árának tízszerese).
Így a humán diabetes kontroll vizsgálata, ill. a többi emlős szénhidrát metabolizmusának nyomonkövetése könnyebbé, egyszerűbbé válik, és ezáltal jobban hozzáférhetővé minden szökséges esetben.
A szerzők köszönetet mondanak a SIGMA ALDRICH KFT., Budapest szíves támogatásáért, akik a módszer beállításához szökséges próba reagenseket rendelkezésönkre bocsájtották.
IRODALOM
Johnson RN, Metcalf PA, Baker JR. Fructosamine: a new approach to the estimation of serum glycosylprotein I. An index of diabetic control Clin Chim Acta 1983; 127: 87-95
Tamás Gy, Kerényi Zs, Ferencz A, et al.: (szerkesztőbizottság) és a "Konszenzus értekezlet a diabetes monitorozás kérdéseiről" résztvevői: Ajánlás a diabetes mellitus egyes laboratóriumi paramétereinek monitorozásához Klin Kísérl Lab Med 1997; 25: 2-3
* Levélcím: Dr. Oppel Klára,
SZIE Szent István Egyetem Gödöllő
Állatélettani és Állategészségtani Tanszék
2103 Gödöllő, Páter Károly u.1